如何制作CRISPR奶牛

基因组编辑为将有用的遗传性状引入家畜育种计划提供了机会。然而，事实证明，使用CRISPR-Cas9系统将大的DNA片段插入牲畜胚胎是困难的。加州大学戴维斯分校的Alison Van Eenennaam博士和Joseph Owen博士利用他们在牛胚胎发生和DNA修复途径方面的知识，并在绿色荧光报告基因的帮助下，培育了一只名为Cosmo的CRISPR牛犊，它携带了多余的牛的副本SRY基因。

几个世纪以来，饲养者们一直在挑选那些表现出理想品质的动物作为下一代的父母。当饲养员根据动物的可见特征(例如皮毛颜色)来选择动物时，他们实际上是在决定个体差异的自然发生的DNA序列差异中进行选择。

使用传统育种，实现预期的变化可能需要几十年的时间。尤其是像牛这样的大型牲畜，它们的世代间隔很长。基因组编辑的进步提供了一个更快地带来有用变化的机会。在这个过程中，特定的DNA序列变异可以直接插入家畜基因组。

用于编辑基因组的一种常用方法是CRISPR/Cas9系统。该系统由两部分组成。切割DNA的Cas9蛋白和引导Cas9切割方向的导向分子。它们结合在一起，形成一个复合物，在目标部位切割DNA。由此产生的断裂称为DNA双链断裂（DSB），然后由细胞的天然DNA修复机制修复。

细胞使用不同的自然机制来修复DSB。非同源末端连接（NHEJ）途径和同源定向修复（HDR）途径是两种可能的修复途径。NHEJ通常会在切割位点附近导致短时间的插入/删除事件（其中一小段DNA插入基因组或从基因组中删除）。或者，HDR可用于从供体模板引入有用的DNA序列。HDR供体修复模板通常包含要插入的DNA片段或基因，两侧为同源臂。这些臂反映了CRISPR靶位点两侧的DNA序列。到目前为止，已经证明利用胚胎中的HDR途径将整个基因插入家畜基因组是非常困难的。

为了避免新基因的插入被细胞的DNA修复系统所阻碍，该团队采用了同源性介导的末端连接(HMEJ)策略。

最近，由加利福尼亚大学Alison Van Eenennaam博士和Joseph Owen博士带领的一个团队在加利福尼亚大学的早期胚胎中使用了CRISPR-CAS9系统，生产了一种携带目标的小牛的插入物。SRY基因。这只小公牛名叫Cosmo，出生于2020年4月COVID-19大流行期间。Cosmo的独特之处在于他还携带着绿色荧光蛋白基因的副本。用荧光作为标记来识别携带目标基因的胚胎SRY基因插入。然后，这些胚胎转移至代孕母牛，和一个随后孕育了宇宙。

为什么这种基因?
的SRY基因携带一种名为“决定性别的Y区”的蛋白质的指令，该蛋白质与男性性发育有关。具体来说，这种蛋白质充当转录因子，这意味着它附着在DNA的特定区域，帮助控制特定基因的活动。这种蛋白质会导致胎儿发育出男性性腺(睾丸)，并阻止女性生殖结构(子宫和输卵管)的发育。继承的SRY基因使胚胎发育成男性。能够生出全雄后代的公牛是肉牛养殖者的理想选择;以同样的方式，奶牛饲养者也希望所有的后代都是雌性的。

设计指南
作为插入的第一步SRY基因导入胚胎后，该团队开发了一种引导RNA。这种引导RNA(单链核酸，而DNA是双链)引导Cas9蛋白在牛17号染色体上的一个特定位置切割。这个位点，H11，是一个已知的“安全港”，这意味着在这个位置的基因插入不会破坏必要的基因。该团队预测，指南将指导Cas9在目标H11位点切割，而不是在其他位置，因为它不匹配任何其他牛DNA序列。这种设计有助于确保Cas9不会在基因组的“脱靶”位置被切断。该指南对目标序列进行了测试在体外， 和体内在牛细胞系中，为了确保它指导Cas9在H11靶基因座的DNA中有效引入DSB。

时间就是一切
一本研究的目的之一是编辑早期胚胎受精后，立即以避免所谓的基因嵌合状态。镶嵌当具有不同基因型的细胞的两个或更多个基团是已经从单一受精卵开发的个体内发生存在。这在编辑过程或胚胎开始只是第一次细胞分裂前复制自己的DNA后发生通常发生。在这项研究有助于避免镶嵌，指导，供体和Cas9蛋白编辑试剂引入牛胚胎受精后只有六个小时，DNA合成开始之前。一个与研究人员希望的基因插入胚胎这个时机的挑战是在回避细胞的主要DNA修复途径。在胚胎发育的早期阶段，维修往往是通过NHEJ途径，而HDR编辑的效率是在早期胚胎很低。

世界上第一个在出生敲入牛市的CRISPR介导HMEJ在早期胚胎重达110磅（50公斤）。

一个插入的策略
为了避免新基因的插入被细胞的DNA修复系统所阻碍，该团队采用了同源性介导的末端连接(HMEJ)策略。在这个过程中，HMEJ捐助模板的设计使得同源臂在两侧由CRISPR靶序列两侧。这种基于HMEJ的方法已被证明是有效的早期阶段1细胞胚胎，用基因插入效率大得多比的替代的基于HDR-策略。要插入SRY该团队设计了一个HMEJ供体模板，H11 CRISPR靶序列位于同源臂的两侧。

然而，使用这种方法进行插入仍然不是100%有效。在最初的实验中，只有大约40%的牛胚胎被发现有这种基因SRY插入。牛胚胎移植以及随后9个月的妊娠都很昂贵。这意味着该团队需要在胚胎转移到代孕奶牛之前确认基因插入是否成功。其中一种方法是使用胚胎活组织检查，从胚胎中取出一些细胞，然后检查植入的细胞是否存在SRY基因。不幸的是，这一程序会降低胚胎的生存能力，特别是如果胚胎随后被冷冻以供日后移植。

研究小组选择了一种不同的筛选方法:“报告基因”。报告基因携带一种易于识别的特征——例如荧光——可以对胚胎进行非侵入性筛选。在这个实验中，水母绿色荧光蛋白(GFP)被包括在一起SRY，夹在HMEJ供体模板上的同源臂之间。荧光蛋白导致任何带有SRY插入时在蓝色至紫外区域暴露于光，以发出绿光。胚胎进行筛选，并于2019年6月，即在紫外光下发绿色荧光9 7天的胚胎转移至代孕母牛。一个月后的一个奶牛，3113，被证实怀孕，以及超声波扫描显示她携带男性公牛犊。

Cosmo的到来
9个月后，在COVID-19大流行期间，Cosmo登场了。世界上第一只由crispr介导的HMEJ敲入早期胚胎的公牛在出生时重110磅(50公斤)。研究小组能够对这头小牛进行详细的基因分析。他们发现Cosmo有好几份GFP：SRY基因在17号染色体对中的一个上，在另一个上有一个小的插入。这表明，当Cosmo是一个新形成的胚胎时，Cas9在17号染色体H11位点引入的DSB被NHEJ修复，导致一个小的26个碱基对插入，而另一个使用hmej供体模板修复，产生多个绿色荧光蛋白和SRY基因插入和供体质粒骨架的副本。

团队希望，在未来的某一天，Cosmo能成为一名父亲。Cosmo未来的后代应该会揭示一些有趣的事情:他们将会继承几份SRY基因导致牛的XX胚胎(正常情况下是雌性)发育成雄性小牛?当然，Cosmo仍然携带着绿色荧光报告基因的几份拷贝。然而，如果没有一个巨大的黑暗的迪斯科舞厅，Cosmo可以暴露在紫外线范围的蓝色光线下，研究人员可能永远无法把Cosmo想象成一个发光的“绿牛”。